PCR in aller Munde

Covid-19 ist schrecklich! Nicht nur, dass man daran schwer erkranken und sterben kann. Schlimm ist zusätzlich, dass die Pandemie unsere Wirtschaft und die Kultur ruiniert sowie die Diskussionskultur beschädigt. Sie spaltet unsere Gesellschaft. Viele Menschen halten sie für die größte Katastrophe seit dem 2. Weltkrieg. Sieht man einmal von absurden Verschwörungstheorien ab, gibt es zwei Sichtweisen: Die Zahl der Infizierten könne exponentiell steigen, zu tausenden Todesfällen und zu einem Zusammenbruch unseres Gesundheitswesens führen. Diese Gefahr könne man nur mit einem rigorosen Lockdown und der Verordnung von Kontaktbeschränkungen einigermaßen bändigen. Es sei alles übertrieben, sagen andere. Covid-19 sei nicht schlimmer als eine Grippeepidemie, auch würden überhöhte Zahlen angegeben. Die PCR, das favorisierte Testverfahren zum Infektionsnachweis, steht in der Kritik. Es ist nachvollziehbar, dass solche Nachrichten Unsicherheit auslösen. Vielleicht ist es hilfreich, den PCR-Test hier einmal zu erläutern.

Corona weckt Interesse an der Wissenschaft

Die Covid-19-Pandemie hat überhaupt nichts Gutes, aber trotzdem ist positiv zu verzeichnen, dass das Virus wissbegierig macht. Menschen, die nie etwas mit Mathematik und Naturwissenschaft zu tun haben wollten, versuchen den Begriff „exponentielles Wachstum“ zu verstehen und sie interessieren sich plötzlich sogar für Molekulargenetik, eine Sparte, die bis vor kurzem heftige Aversion auslöste.
Sie wollen erfahren, wie das Virus uns angreift, wie Nachweismethoden funktionieren und wie Menschen Immunität erreichen können. Als wir 1986 in der Medizinischen Akademie Magdeburg anfingen, die PCR-Methode anzuwenden, hätte ich nicht im Traum daran gedacht, dass der Begriff „PCR“ einmal in den Sprachgebrauch der Politiker und breiter Bevölkerungskreise eingehen würde. Heute ist er in aller Munde. Aber es gibt auch darum Diskussionen. Es sei eine schlechte Methode, die nicht geeignet sei, Infektionen zu diagnostizieren usw. Sogar einige Wissenschaftler reden die PCR schlecht. Was ist das eigentlich, die PCR?

PCR: Polymerase-Chain-Reaction (Polymerase-Ketten-Reaktion)

Zunächst sind Begriffe zu klären. Ein Polymer (von altgriechisch, polý = viel und méros = Teil) ist ein Stoff, der aus vielen gleichen oder ähnlichen Teilen aufgebaut ist. DNA und RNA sind solche Makromoleküle. DNA- und RNA-Polymerasen sind Enzyme, die komplexe Moleküle zu Riesenmolekülen, eben DNA bzw. RNA, verknüpfen (polymerisieren). Kettenreaktionen sind uns aus der Physik bekannt, etwa aus Kernreaktoren. In dem hier besprochenen Zusammenhang wird der Begriff benutzt, weil ein in diesem Prozess entstandenes Molekül Ausgangspunkt für eine weitere Synthese ist, und das in einer langen Kette von Folgereaktionen.

Um die PCR zu verstehen, muss man etwas über DNA wissen. DNA ist die Abkürzung eines langen chemischen Namens für unsere Erbsubstanz. Die Bau- und Funktionspläne aller Lebewesen sind jeweils in individuellen Varianten darin festgeschrieben. Bis auf wenige Ausnahmen verfügen alle Zellen von Lebewesen über DNA. Die stellt sich dar als eine Doppelstruktur von 2 fadenförmigen Molekülen, die sich spiralförmig umeinander schlingen, Doppelhelix genannt. Wenn sich die Zellen teilen, muss die DNA verdoppelt werden, damit jede Tochterzelle mit der gleichen genetischen Information ausgestattet werden kann. Dazu windet sich die Doppelhelix auf und die DNA-Polymerase synthetisiert an jedem der nun vorliegenden Einzelfäden ein spiegelbildliches Molekül. Somit hat sich die DNA verdoppelt. Diesen Prozess kann man auch „in vitro“, also außerhalb von Zellen, in Reaktionsgefäßen durchführen. Die dazu benötigten DNA-Bausteine und die Polymerase kann man aus Lebewesen gewinnen, z. B. aus Bakterien. Bedeutsam ist noch, dass die Polymerase die DNA-Synthese nicht irgendwo beginnen kann, sondern sie braucht Startpunkte. Für den In-vitro-Prozess kann man diese Starter, die wir Primer nennen, synthetisieren. Es sind kurze einsträngige DNA-Schnipsel, die sich an die Einzelstränge heften, nachdem sich die Doppelhelix aufgespalten hat. Die Bausteinreihenfolge in den Primern wird so gewählt, dass sie sich zielgenau an ein einsträngiges DNA-Molekül anlagern und somit den Startpunkt der Synthese festlegen. Auf diese Weise kann man Bereiche der DNA auswählen, die man verdoppeln will. Die Arbeitsgänge sind wie folgt: In das Reaktionsgemisch pipettiert man die zu untersuchende DNA, die DNA-Bausteine, die Primer und die Polymerase. Der erste Schritt in jedem Zyklus ist die Trennung der Doppelhelix in Einzelstränge. Das geschieht durch Erhitzen auf 92°C, dann senkt man die Temperatur. Jetzt finden die Primer ihren Bindungsort. Dann erhitzt man das Gemisch auf 72° C. Hier haben die verwendeten Polymerasen ihr Reaktionsoptimum und bauen den Tochterstrang auf. Vermehrt werden in der Regel kurze DNA-Abschnitte mit Längen von einigen hundert Bausteinen. Bei der PCR führt man nacheinander 25 bis 35 Verdoppelungsreaktionen aus, wobei eine gewaltige Anzahl identischer DNA-Kopien entsteht.

An dieser Stelle ist ein kleiner Einschub zum Begriff „Exponentielles Wachstum“ angebracht. Das begegnet uns ja nicht nur im Zusammenhang mit der PCR, sondern auch mit dem Infektionsgeschehen von Covid-19. Exponentielles Wachstum wird sehr anschaulich in der Erzählung von dem Schachbrett und den Reiskörnern erklärt.

Exponentielles Wachstum

Der indische Kaiser Sheram war von dem Schachspiel so begeistert, dass er dessen Erfinder namens Zeta belohnen wollte. Zeta sollte einen Wunsch äußern und dabei nicht bescheiden sein. Dieser entgegnete: „Gebieter befiehl, mir für das erste Feld des Schachbrettes 1 Reiskorn auszuhändigen, 2 Körner für das zweite Feld, 4 für das dritte und für jedes weitere Feld doppelt so viele Körner wie für das vorhergehende“. Der Kaiser war beleidigt, da ihm der Wunsch zu läppisch vorkam. In Wahrheit war Zeta mehr als unbescheiden! Errechnet man für die ers-ten 10 Felder die Anzahl der Reiskörner, ergeben sich 1; 2; 4; 8; 16; 32; 64; 128; 256; 516. Das ist noch wenig, aber dann geht‘s richtig los. Beim Feld 20 sind wir schon bei 524.288 und bei Feld 30 bei 536.870.912. Für das Feld 64 sind es 9.223.372.036.864.775.808 (9 Trillionen, 223 Billiarden, 372 Billionen, 36 Milliarden, 864 Millionen, 775 Tausend und 808). Geht man davon aus, dass 33 Reiskörner etwa 1 Gramm auf die Waage bringen, wären das etwa 277 Milliarden Tonnen Reis.
Zurück zur PCR: Wenn wir standardmäßig 30 Verdoppelungszyklen ausführen, liegt rechnerisch die Anzahl der DNA-Kopien bei 1.073.741.834 pro Ausgangsmolekül. Da wir aber in unserem Reaktionsmix schon zu Beginn mit einer größeren Menge von Molekülen starten, kommen wir zum Schluss auf eine sehr hohe Zahl von DNA-Kopien. Das gilt trotz der Tatsache, dass die Effizienz der Verdoppelung unter 100% liegt. Auf jeden Fall erhält man im Normalfall ausreichend Material, um daraus die gewünschten Schlüsse ziehen zu können.
Exponentielles Wachstum ist auch für das Infektionsgeschehen zu befürchten. Wenn jeder Infizierte 2 weitere Personen anstecken würde, hätten wir einen Reproduktionsfaktor 2 und einen Zuwachs wie in der Schachbretterzählung. Aber auch wenn wir einen R-Wert von 1,1 haben (100 Infizierte stecken 110 andere an), steigen die Zahlen exponentiell. Damit die Anzahl der Infizierten abnimmt, müssen wir auf einen R-Wert von unter 1 kommen!

PCR – eine Kombination aus Naturwundern und Genialität

Für die Erfindung der PCR wurde Kary Mullis (1946-2019) mit dem Nobelpreis ausgezeichnet. Er hatte sie im Jahr 1983 entwickelt. Die PCR war von nun an eine der wichtigsten Methoden der Molekularbiologie. Seine Idee war genial, aber er hatte auch Glück. Schon 10 Jahre zuvor hatte der Norweger Kjell Kleppe einen Prozess zur Vervielfältigung von DNA-Abschnitten entwickelt. Sein Pech war es, nur eine Polymerase aus dem Darmbakterium Escherichia coli nutzen zu können. Die ist wärmeempfindlich und überlebt den jeweils ersten Schritt des PCR-Zyklus´ nicht, nämlich die Erhitzung auf 92°C. Deshalb war sein Verfahren nicht praktikabel. Mullis stand eine Polymerase aus Thermus aquaticus zur Verfügung Das ist ein Bakterium, das in Geysiren lebt und eine Temperatur von ca. 75°C liebt. Deren Polymerase hält der 92°C-Behandlung stand und deshalb muss die PCR während der Prozedur nicht mit neuer Polymerase „nachgefüttert“ werden. Somit wurde die PCR zu einem handhabbaren Verfahren. Hätten Sie, verehrte Leserin, verehrter Leser, sich vorstellen können, dass es Lebewesen gibt, die bei 110°C gedeihen? Solche Wassertemperaturen gibt es in der Tiefsee an Orten mit vulkanischer Aktivität. Hier findet man hyperthermophile Bakterien. Sie sind ein Wunder der Natur und deren Polymerase verträgt Temperaturen um 100°C. Sie sind ein willkommenes Werkzeug für die PCR. Ein Wunderwerk der Wissenschaft ist hingegen, dass Biotechnologen Gene der verschiedensten Organismen in das Bakterium E. coli transferieren konnten. Diese „transgenen Organismen“ wachsen nun in Tanks und produzieren die begehrten Enzyme in industriellem Maßstab. Das trifft auch zu auf das Enzym „Reverstranskriptase“, das bei der PCR zum Nachweis des Virus SARS-CoV-2 eine Rolle spielt.

Besonderheiten beim PCR-Test auf SARS-CoV-2

Die PCR ist eine Methode der DNA-Analytik, aber SARS-CoV-2 ist ja ein RNA-Virus. Damit das Virus mit der PCR nachgewiesen werden kann, muss man von dessen RNA zunächst eine DNA-Kopie herstellen. Wir erinnern uns: In den Zellen sind alle Pläne für das Leben in Genen festgeschrieben, z. B. die Baupläne für die Eiweiße. Die DNA-Informationen werden übersetzt (transkribiert) in ein RNA-Molekül. Das macht das Enzym DNA-RNA-Transkriptase. Die RNA ist von ihrer Struktur her der DNA sehr ähnlich. Sie bringt die Eiweißbaupläne zu den Orten ihrer Synthese. Ursprünglich dachte man, dieser Prozess sei unumkehrbar, aber dann entdeckte man die Retroviren, von denen das Human-Immundefizienz-Virus (HIV) als AIDS-Erreger wohl das bekannteste ist. Diese RNA-Viren besitzen eine „Reverstranskriptase“, die die RNA in DNA umschreibt. Auch dieses Enzym wird indus-triell produziert und steht als molekularbiologisches Werkzeug zur Verfügung. Die SARS-CoV-2- RNA kann nun also in reverser Transkription in ein DNA-Molekül umgeschrieben und anschließend vervielfältigt werden. Der Prozess heißt jetzt: Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR).
Obwohl die PCR eine exzellente Technik darstellt und der Test außerordentlich empfindlich ist, gibt es doch reichlich Kritik. Der Vorwurf lautet, dass es zu viele falsche Testergebnisse gebe. Aber das stimmt nicht. Allerdings kann es vorkommen, dass eine Infektion nicht erkannt wird. Das liegt meist daran, dass der Abstrich zu wenig Virusmaterial enthält. Dann wird der Test falschnegativ. Auch ist es möglich, dass der Test das Vorhandensein von Viren-Trümmern anzeigt, diese aber nicht mehr infektiös sind und die PCR somit Fehlalarm auslöst. Die Stärke des PCR-Tests ist seine hohe Empfindlichkeit, aber das birgt auch Gefahr. Der größtmögliche Störfall ist, dass ein Labor mit PCR-Produkten, die in vorhergehenden Tests produziert worden sind, kontaminiert wird. Dann könnten Spuren davon auch in die Proben gelangen und falschpositive Ergebnisse verursachen. Einzelne seltene Vorkommnisse dieser Art dominieren die Schlagzeilen, so dass ein falscher Eindruck entsteht. Das Risiko ist in Wirklichkeit sehr klein, weil die exponentielle Vermehrung der PCR-Produkte direkt in den Reaktionsgefäßen gemessen wird, ohne dass diese geöffnet werden müssen. Außerdem gibt es in PCR-Labors ein ausgefeiltes Qualitätsmanagement, so dass man schnell erkennt, wenn etwas schief läuft. Die tatsächliche Häufigkeit von falschpositiven Ergebnissen liegt unter einem Prozent. Das ist eine akzeptable Größenordnung.

Danke, dass Sie den vielleicht etwas komplizierten Text bis hierher gelesen haben. Bleiben Sie PCR-negativ und im Denken positiv!

Von Prof. Dr. Reinhard Szibor

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